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平時在實驗室最常聽到的一句話就是「實驗為什么會是這樣的呢」。然后仔細一查找原因，往往是由于操作上面的不認真，或是一些小小的細節(jié)沒有注意到。

小編為大家整理了實驗小技巧，希望對大家有幫助。

質(zhì)粒 DNA 提取

提取質(zhì)粒的時候，最后一步的酒精揮發(fā)很關鍵，基本上是其后續(xù)的酶切反應的決定性因素。所以這一步盡量揮發(fā)長一點時間，最好是空調(diào)吹熱風，或是 37℃ 溫箱放長一點的時間，我試過室溫過夜，酶切很好。

將 Amp 濃度提高到 200 ug/ml，下班前接種，次日一早收獲菌體，OD 雖然不高，質(zhì)粒豐度卻不一般。菌體量少些，操作體積（管數(shù)）也?。ㄉ伲?/span>

手提質(zhì)粒，如果用氛氯仿和氯仿兩步抽提，注意一下手法，嚴格按照參考書上面的操作的話，提出的質(zhì)粒不比任何質(zhì)粒提取試劑盒差，我感覺好像還好一點，我就用過一次試劑盒，比較了之后不如我手提的好，以后再也沒用過了。

Western Blot

做 western blot 的時候，大家往往會摸索一抗、二抗的濃度，封閉時間，曝光時間等等，而每次變換其中的一個條件就需要重新跑膠、轉膜，甚至重新提蛋白，這樣會浪費大量的時 間。其實完全沒有必要這樣。一次轉膜后，將 PVDF 膜晾干，裁減成小塊，保存起來，用的時候取出一塊，沒有任何影響。這對于摸索條件的戰(zhàn)友來說，節(jié)約了大量的時間。

做 western blot 轉膜時，膠放在轉膜緩沖液中一段時間，待膠在含有甲醇的緩沖夜中縮小的差不多后裝好轉膜裝置，我的經(jīng)驗是把膜印在膠上直接在膜上畫出預染 maker 條帶，方便的很。因為很多時候跑電泳時膠上的預染 maker 很清楚，等轉膜后就不是分辨的很清楚了。要注意畫好預染 maker 后就不要使膠和膜發(fā)生對位移動了，以防 maker 失去參照價值。

器具的清潔非常重要，開始做前，為了安全，尤其是裝膠的厚薄玻璃板，可以先用中性洗滌劑和自來水反復沖洗，確保無洗滌殘液后用蒸餾水沖洗 2-3 遍，然后用去離子水沖洗一遍。最后用 95％ 酒精再擦一遍后晾干備用。

配膠最好現(xiàn)用現(xiàn)配，先配下層膠（分離膠），后配上層膠（濃縮膠或積層膠），而且在臨灌膠前加 APS 并迅速混勻，即用移液槍抽吸與注入1-2 次即可。

緩沖液和培養(yǎng)基配置

將緩沖液配方中的成分分別以 10-100 倍配成母液儲存，需要的時候只需將相應的母液混合，補加水稀釋即可；

配 培養(yǎng)基時通常會忘記各成分的量，如配 LB 時的三個成分不記得到底哪個是 5 g，哪個要 10 個，因此可以在常用的試劑瓶的標簽上注明所需的量，如配 LB 時，在 NaCl 瓶外注明 10 g/L， yeast 5 g/L， tryton 10 g/L 等，很方便，不需要每次配之前臨時翻書。

PCR

在 做克隆鑒定的時候經(jīng)常需要在酶切鑒定前進行 PCR 鑒定，每次配制 PCR 反應液很繁瑣，可以將其配置類似kit的形式，按你需要的反應體系列表，然后放大 100 倍配制 100×主反應液（100 次反應），其中含 buffer，Mg2+，dNTPs，但不含引物和 Taq 酶，然后可以 10× 分裝或一管儲存在－20℃，在需要的時候拿出融開，然后按所需的 PCR 反應個數(shù)吸取相應的倍數(shù)，再補加相應反應倍數(shù)的 Taq 和引物，混勻后分裝。

這樣做的好處如下：可極大的節(jié)省寶貴的時間，可早點收工，看球；避免每次反應加樣不均的可能；大大減少 PCR 假陽性的產(chǎn)生。

酶切

如果是要做酶切，提質(zhì)粒的最后一步最好是用水溶解 DNA，因為 TE 里面的離子會影響酶切的效率。

雙酶切制備克隆插入片段的載體，最好選擇帶有外源片段的質(zhì)粒，是否酶切完全，從電泳條帶的分子量上可以比較明確地判斷?？召|(zhì)粒單切完全和雙切完全在分子量上差異不大。

在 做酶切時，也可以象 PCR 一樣配制主反應液，每次反應前先列好反應的體系，算好需要的反應數(shù)，然后按所需反應的體系按所需反應數(shù)放大，加入 buffer、酶、水，質(zhì)粒欄空缺，然后混合后按質(zhì)粒 DNA 的體積分裝，然后再在每管中加入相應體積的質(zhì)粒 DNA 酶切。

這樣做的好處如下，特別是當同時有十幾個陽性克隆需要鑒定時尤為明顯：各反應成分均一；可大大減少限制型內(nèi)切酶的使用；節(jié)省時間。

大腸桿菌轉化實驗

有 時候第一天涂的轉化平板、次日早晨轉化子可能長成的菌落比較大（1~2 mm 以上，BL21 就長得快），下一步轉化子做質(zhì)粒鑒定。這個情況下可以直接挑取一塊菌苔（勿帶出培養(yǎng)基），50 ul 酚/氯仿懸浮菌體，放置兩分鐘，加 40 ul TE 抽提，上層 TE 吸出后再氯仿抽提一次，吸取上層 TE 即質(zhì)粒提取液。提取的質(zhì)?？梢灾苯佑糜陔娪竞兔盖?。這樣操作，可以省去轉接液體試管的培養(yǎng)步驟，至少節(jié)省 6~8 h的時間。但是，要在各步驟都控制得很好的情況下才能保證提取和酶切的效果，不同的實驗室或者操作者未必能夠很方便地重復。

轉化時一定要做一個宿主菌的對照，即重組質(zhì)粒涂板后再用宿主菌涂相應抗性的平板，以確定第二天長出來的克隆是否正確，我當時做了三次轉化之后才發(fā)現(xiàn)不成功竟然是由于 BL21 可以在 Amp（+）的平板上面生長。

蛋白質(zhì)的表達、分離、純化

當?shù)鞍状罅康谋磉_時，包含體的形成幾乎是不可避免的，而且很難通過改變一些誘導條件來改變，最有效的辦法就是換表達系統(tǒng)，所以如果時間還充分的話，可以嘗試一下，如果時間較短了，還是安心的做包含體蛋白的處理，變性之后的蛋白通過一些方法復性率也可以達到 60％ 以上。

細胞凍存和復蘇實驗

可以提前把需要的體積的培養(yǎng)液放到培養(yǎng)瓶里，擰松瓶蓋，放到孵箱里半小時到 1 h，這樣溫度和 pH 值都已經(jīng)最適合細胞生長了。

為 防止凍存管在升溫時爆裂等，可以在放入水浴前就提前在超凈臺里把蓋子擰松一下然后再擰上。從液氮罐里拿出來不是說一定要分秒必爭地放入水浴。細胞從液氮的 零下100 多度升到比如 - 80℃ 這個過程對細胞沒有損害。有足夠的時間處理這些。只不過一旦細胞化了，就應該爭分奪秒地把它放入培養(yǎng)液了，主要是為了稀釋 DMSO。常溫下高濃度 DMSO 對細胞的損害比較大。

水浴溫度 40℃ 應該也沒問題，但正規(guī)的 protocol 上從來都只說 37℃。反正應該相差不大，但不能太高了。另外，不必等細胞全化了再從水浴里取出來。只要冰塊浮起來了就差不多了。我一般最多水浴不超過 1.5 min。然后經(jīng)過噴酒精消毒什么的差不多又半分鐘過去了。每次都還有沒化的。先把已經(jīng)融解的部分吸到培養(yǎng)瓶里，再從培養(yǎng)瓶里吸些培養(yǎng)液到凍存管里，余下的 冰塊瞬間就化了，再一起吸到培養(yǎng)瓶里。